IHC 实验中组织样本准备的细节及方法

载玻片

高质量的免疫组组化结果需要组织切片与载玻片之间很好地结合，以防止由于组织黏附问题导致的试剂聚集和假染色。商品化的专门用来进行免疫组织化学染色的载波片是经过标准化包被的。这里将介绍两种方法对常规载波片包被以用于免疫组织化学染色。
 

a、聚左旋赖氨酸（poly-L-lysine) 包被玻片法

       1、准备 0.1%(w/V) 聚左旋赖氨酸水溶液 (Sigma P-8920）。
       2、将载玻片浸入溶液中。
       3、室温干燥。
       4、室温保存。

b、 APTS 包被玻片法

       1、准备含 2%(V/V SIH4(Sigma A-3648) 的丙酮溶液。
       2、将载玻片浸人丙酮中 1～5 min。
       3、将载玻片浸入含 2%SIH4 的丙酮溶液中 1～5 min。
       4、将载玻片在丙酮溶液中连续洗两次, 每次 5 min。
       5、室温干燥并储存。

细胞涂片/离心细胞涂片制备

       1、在 SIH4/聚左旋赖氨酸包被的载玻片制备细胞刮片/细胞离心涂片。
       2、室温下干燥 30 min。
       3、在预冷的、新鲜的丙酮中一 20℃ 固定 20 min。
       4、室温下风干至少 15 min。
       5、对细胞刮片/细胞离心涂片染色。

注意事项

       ①  100% 乙醇可代替新鲜丙酮使用；固定剂的选择取决于组织中要染色的目的抗原。
       ②  未染色的载玻片可以包被在铝箔中,-20℃ 保存。当准备染色时: 打开铝箔，取出载玻片并恢复至室温，用保存之前相同的固定剂进行后固定至少 30s，风干切片，在缓冲液中再水化 5 min，然后进行染色。
       ③  未染色载玻片的稳定性取决于抗原性质；一些抗原很不稳定必须涂片后立刻染色。

冰冻切片

       1、切 4 个 7um 厚的未固定的冰冻切片。
       2、将切片置于 SIH4/聚左旋赖氨酸包被的载玻片上。
       3、将切片在空气中风干 30 min。
       4、置于预冷至 4℃ 的新鲜丙酮中，固定 20 min。
       5、室温风干切片至少 15 min。
       6、将切片染色。

注意事项

       ①  100% 乙醇可替代新鲜丙酮使用；固定剂的选择取决于组织中要染色的目的抗原。
       ②  未染色的载玻片可以用铝箔包裹，-20℃ 保存。当准备染色时：打开铝箔，取出载玻片并恢复至室温，用保存之前相同的固定剂进行后固定至少 30s，风干切片，在缓冲液中再水化 5 min，然后进行染色。
       ③  未染色载玻片的稳定性取决于抗原性质, 一些抗原很不稳定必须涂片后立刻染色。

石蜡切片

       1、将组织在 10% 甲醛 (其他的固定剂也可能更合适) 中固定 12-48 h。固定时间取决于组织厚度、温度及待检抗原的性质。
       2、石蜡包埋。
       3、切 3～5um 厚的切片。
       4、将切片置于 SIH4/聚左旋赖氨酸包被的载玻片上，使用无黏附剂的水浴。
       5、沿切片边缘吸干水。
       6、将切片置于 60℃ 烤箱中 30～60 min。
       7、脱蜡后, 将切片染色。

注意事项

       ①  对于富含脂肪的组织 (如脑、乳腺) 延长风干时间 (如室温下过夜) 可能增强组织切片的黏附。
       ②  干燥温度超过 60°C 可能对某些抗原的检测产生不利影响或者增加背景染色。
       ③  无论储存条件如何，延长石蜡切片的储存时间都可能降低某些抗原的免疫反应性。根据作者经验，雌激素受体、孕激素受体、细胞周期调节相关蛋白质 (如 Ki-67、PCNA、cyclinD1、bcl-6)、甲状腺转录因子-1 抗原等容易降解，因此石蜡块的切片不适合长时间储存。
       ④  如果存档的石蜡切片的染色出现不一致, 应该用新鲜切片重复一次实验。

细胞块

这一步骤适用于由于组织块太小导致普通石蜡包埋变得困难，需要一种能形成所谓细胞块的试剂。以下是四种不同的细胞块制备法：

一、琼脂细胞块制备法

       1、取底部沉淀样本 20 ml，3000 转/分，离心 5-10 分钟。
       2、吸干上清液，离心沉渣用 10% 中性福尔马林固定 1 小时。
       3、吸干液体。
       4、滴加少许融化的琼脂，摇动试管使其充分混合，3000 转/分，离心，5-10 分钟。此时，琼脂已凝固。
       5、将琼脂块取出，切成大小合适的块状放入脱水盒，按常规制备蜡块。

二、蛋清细胞块制备法
       1、取底部沉淀样本 20 ml，3000 转/分，离心 5-10 分钟。
       2、加鸡蛋清 lml，用扁平的竹签轻轻刮取试管底部的细胞，尽量使细胞成团悬浮于蛋清中，离心 5 min(2000 转/ min)。
       3、去除多余蛋清，沿管壁轻轻加入 10 % 中性福尔马林固定液 2 ml。蛋清遇到福尔马林立即凝固使细胞成团块状，轻轻摇动，让细胞团块悬浮于固定液中固定，过夜，轻轻取出细胞团块，用包埋纸包好，放入脱水盒，按常规制备蜡块。

三、直接细胞块制备法（当细胞量较多时可使用）

       1、取底部沉淀样本 20 ml，3000 转/分，离心 5-10 分钟。
       2、吸干上清液，轻轻沿管壁加入 95% 酒精，3000 转/分，离心 5 分钟，静置 1 小时。
       3、用竹签轻轻将沉淀物取出，用包埋纸包好。
       4、放入脱水盒，10% 中性福尔马林固定 1 小时，按常规制备蜡块。

四、C₅H₈O₂ 细胞块制备法

       1、取底部沉淀样本 20 ml，3000 转/分，离心 5-10 分钟。
       2、吸干上清液，加入 3 %  C₅H₈O₂ 10 ml，充分混合,3000 转/分，离心 5-10 分钟。
       3、用竹签轻轻将沉淀物取出。
       4、放入脱水盒，10% 中性福尔马林固定 1 小时，按常规制备蜡块。