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原核蛋白表达常见问题分析

人阅读 发布时间:2021-05-12 11:11

原核表达是指通过基因克隆技术,将外源目的基因,通过构建表达载体并导入表达菌株的方法,使其在特定原核生物或细胞内表达。原核蛋白表达系统是目前最常用、最经济的蛋白表达方法。大肠杆菌表达系统是应用最广泛的原核蛋白表达系统之一。一个完整的表达系统通常包括配套的表达载体和表达菌株。如果是特殊的诱导表达还包括诱导剂,融合表达还包括纯化系统或者 Tag 检测等等。选择表达系统通常要根据实验目的来考虑,比如表达量高低,目标蛋白的活性,表达产物的纯化方法等等。下面介绍下原核表达过程中常见问题。
 

— 01 —


Q:为什么目的蛋白总是以包涵体形式出现?

A:在原核表达纯化中目的蛋白经常发生错误折叠,并聚集成为包涵体。经过诱导后目的蛋白表达通常可达细胞总蛋白的 50% 以上,虽然有一定比例的蛋白以可溶形式存在,多达 95% 的蛋白则存在于包涵体。为了获得更多可溶蛋白,在实验过程中,可以降低诱导温度,例如 16-30℃,或降低 IPTG 浓度(0.01-0.1mM)并延长诱导时间,还可以采用特别的培养基培养细菌。

 

— 02 —


Q:跨膜蛋白为什么很难表达?

A:跨膜蛋白的表达成功率相对较低是一个常见问题,主要原因可能有两个:

1. 跨膜蛋白一般都是强疏水性的氨基酸分子和亲水性的分子跳跃式链接,形成的亲水疏水的一个最简单的跨膜化学结构,这种结构和信号肽结构形似。而对于原核细胞来说,简单的细胞器很难像真核细胞一样完成信号肽的识别及切除、引导内质网、高尔基体重新包装及分泌这一复杂过程,有些蛋白多次跨膜,对于原核细胞来说几乎是不可能完成的任务。

2. 对于疏水性片段,在原核细胞表达中非常容易形成包涵体,疏水性多肽会抑制翻译过程,甚至与原核膜结构融合形成毒性,处于生物自我保护的本能,所有细胞器都会停止合成蛋白的过程。

 

— 03 —


Q:如何选择蛋白表达宿主菌?

A:原核表达系统和真核细胞偏爱的密码子不同,因此,在用原核系统表达真核基因的时候,真核基因中的一些密码子对于原核细胞来说可能是稀有密码子,从而导致表达效率和表达水平很低。蛋白表达问题及菌株选择有以下几种:

1. 无蛋白表达或出现截短蛋白

可能原因是大肠杆菌的密码子偏移性。需要补充稀有密码子 tRNA, 或将稀有密码子突变为普通大肠杆菌密码子。

​建议表达菌株:Rosetta 2, Rosetta-gami 2, Rosetta-gami B, RosettaBlue

2. 表达为包涵体蛋白

可能原因一是目的蛋白含有二硫键,二硫键形成困难,可以利用促进二硫键形成的各种载体标签,建议表达菌株是 Origami 2, Rosetta-gami 2, Rosetta-gami B;二是表达过快,表达量过高,可以降低诱导温度,IPTG 浓度优化,建议表达菌株是 Tuner, Rosetta-gami B。

3. 蛋白无活性

可能原因是蛋白错误折叠。可以利用促进二硫键形成的各种载体标签,建议表达菌株是 Origami 2, Rosetta-gami 2, Rosetta-gami B,也可以降低诱导温度,IPTG 浓度优化,建议表达菌株是 Tuner, Rosetta-gami B。

4. 细胞死亡,生长极困难

可能表达的是毒性蛋白,需要更严格的本底表达控制,建议表达菌株 pLysS。

 

— 04 —


Q:能不能说一下原核蛋白纯化方式及选择方法

A:蛋白纯化方法常用的有亲和纯化、离子交换、切胶回收。

​1. 一般带有 HIS,GST,SUMO,Fc 等融合标签的蛋白,我们可以通过 Ni 柱、GST 柱、protein A 等进行亲和纯化,用亲和纯化方法一般可以获得 85% 以上纯度的蛋白,方便快捷。

​2. 如果不想让重组蛋白带有标签,可以先表达带标签重组蛋白,亲和纯化后用蛋白工具酶切割融合蛋白,再纯化除去工具酶。或者直接表达无标签重组蛋白,进行离子、分子筛、疏水等纯化。

​3. 如果需要表达的蛋白作为抗原,可以直接通过切胶回收的方式,此方法获得蛋白纯度较高,进行免疫后获得的抗体进行 WB 实验,灵敏度较高。

 

— 05 —


Q:获得的蛋白是有活性的吗?

A:要让原核表达重组蛋白有活性,条件很复杂,合适的缓冲液体系、盐浓度、蛋白折叠状态甚至检测活性的方法的差别都可能导致蛋白活性差异。一般情况下,上清表达的蛋白要比包涵体经过变复性纯化得到的蛋白活性要好,所以我们尽量从上清中获得蛋白,期许蛋白折叠达到最接近活性状态。

 

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