- 移动端
武汉菲恩生物科技有限公司品牌商
9 年
手机商铺
- NaN
- 0.2999999999999998
- 0.2999999999999998
- 2.3
- 2.3
推荐产品
公司新闻/正文
过夜染色 | 流式实验提升效果新利器！
5846 人阅读发布时间：2025-10-31 11:33
流式抗体过夜染色是一种有效优化策略，适用于弱表达抗原或低亲和力抗体检测。通过延长孵育时间，使抗原抗体结合更充分，提升信号分辨率，减少背景干扰，提高灵敏度与数据准确性。同时，有助于降低实验变异性和抗体用量，节约成本。结合合适实验条件，过夜染色可显著改善复杂样本的检测效果，提升流式结果的稳定性和可重复性。
一、方法
表面染色与细胞内染色步骤略有不同，总体流程如下：
细胞准备：每样本使用200万个细胞，FACS缓冲液为PBS + 2.5% FCS + 2 mM EDTA。
封闭：鼠源细胞用CD16/32抗体封闭30分钟，人源细胞用Fc Block处理。
表面染色：加入荧光抗体，4℃孵育16小时（或30-60分钟对照）。
细胞内染色：刺激细胞后，完成表面染色 → 固定 → 破膜 → 在破膜液中加抗体过夜孵育 → 次日洗涤后上机检测。
二、过夜染色如何提升实验效果
研究显示，延长染色时间可显著增强荧光信号。以小鼠脾细胞表面CXCR5染色为例，比较15分钟、30分钟、60分钟及16小时的染色效果，发现随着孵育时间增加，荧光强度（MFI）明显提升。尤其在16小时染色条件下，抗体用量可减少至原来的十分之一，仍能获得与30分钟染色相当的信号强度，表明延长染色时间有助于提高灵敏度并降低抗体消耗。
在人调节性T细胞检测中，CD25和CD127的过夜染色相比30分钟染色显著增强信号强度，扩大动态范围，使记忆T细胞群体设门更清晰。
三、细胞内染色同样受益
过夜染色不仅适用于表面抗原，对细胞内甚至核内蛋白如IL-2和Foxp3也显著提升检测灵敏度。例如，在小鼠脾细胞刺激实验中，破膜处理后进行IL-2过夜染色，其信号强度明显高于30分钟染色，且未刺激对照组无非特异性信号，表明该方法在增强灵敏度的同时保持了良好的特异性。
四、延长孵育时间可减少结果变异性和批次效应
延长抗体孵育时间有助于降低实验批次间的变异性。由于抗体-抗原结合是可逆反应，在短时间孵育中，结合速率快于解离速率，微小的时间差异易导致荧光信号波动，影响定量准确性。而延长至16~20小时可使反应接近平衡，信号更稳定。结合标准化操作，过夜染色可显著减少批间差异，提升实验重复性。实际数据显示，相比30分钟染色，隔夜染色不仅降低变异，还提高了分辨率，t-SNE分析也证实其批效应更小。
五、增加孵育时间可以降低成本
抗体滴定是流式实验成功的关键因素。抗体浓度过低会导致阳性与阴性信号难以区分，而过高则可能引起非特异性结合，使阴性群体信号偏移，影响结果分析。因此，必须优化抗体浓度。值得注意的是，相比30分钟染色，过夜染色通常可减少抗体用量，一般可降低5至100倍，同时仍能获得清晰信号，提升检测灵敏度和特异性。
六、增加了panel设计的灵活性
在多色流式panel设计中，有时需使用次优荧光素标记抗体，影响检测效果。但结合固定和过夜染色，可提升信噪比，增强分辨率，提高panel灵活性。例如，CD3-BV570在30分钟染色中难以区分阳性与阴性群体，而过夜染色即使使用更低浓度也能清晰分离。类似情况也见于Tbet-BV605和NKp46-PerCP-Cy5.5，延长孵育时间有助于抗体更充分结合抗原表位，提升检测灵敏度与特异性。
对科研人员而言，花费一晚时间换取更高分辨率的实验结果，远比反复进行低质量实验更高效、更值得。菲恩生物为科研人员提供专业支持，涵盖染料选择建议、补偿调节优化及数据分析指导，助力高效开展多色流式实验，提升检测的灵敏度与准确性。
以下是菲恩生物推荐的流式抗体搭配方案
| 流式抗体推荐 | |||
| 种属 | 细胞群 | 流式抗体搭配 | 货号 |
| Human | T/B/NK细胞群检测 | CD45-PerCP | PCP-30039 |
| CD3-FITC | FITC-30004 | ||
| CD16-PE | PE-30061 | ||
| CD56-PE | PE-30008 | ||
| CD19-APC | APC-30066 | ||
| Human | Th1/Th2 细胞群检测 | CD3-PerCP-Cy5.5 | PCP55-30004 |
| CD4-FITC | FITC-30005 | ||
| IFN-γ-PE | PE-30053 | ||
| IL4-APC | APC-30043 | ||
| Mouse | Th1/Th2 细胞群检测 | CD3-PerCP-Cy5.5 | PCP55-30002 |
| CD4-FITC | FITC-30128 | ||
| IFN-γ-PE | PE-30074 | ||
| IL4-APC | APC-30026 | ||
| Human | Treg细胞群检测 | CD4-FITC | FITC-30005 |
| CD25-PE | PE-30035 | ||
| CD3-PerCP-Cy5.5 | PCP55-30004 | ||
| CD127-FineTest®647 | F647-30033 | ||
| Mouse | Treg细胞群检测 | CD4-FITC | FITC-30128 |
| CD25-APC | APC-30017 | ||
| FOXP3-PE | PE-30111 | ||