流式实验指南 | 荧光蛋白的分类与应用

荧光蛋白的应用核心在于基因融合技术。将其基因与目标基因连接后共表达，可形成兼具功能与荧光的融合蛋白。这使科学家能实时观察目标蛋白在活细胞中的表达、定位及动态变化，评估转染效率与基因活性，并构建荧光生物传感器，用于检测细胞内pH、钙离子、氧化还原状态等生理参数。

尽管荧光蛋白在显微成像中表现优异，但在流式细胞术中面临诸多挑战：细胞通过激光点的停留时间极短，要求荧光信号强、亮度高；需匹配流式仪的特定激光（如488nm），激发效率受限；且其发射光谱较宽，易导致不同荧光蛋白及传统染料间发生光谱重叠，增加补偿难度。因此，并非所有成像适用的荧光蛋白都适合流式应用。接下来，我们将按颜色分类，解析适用于流式检测的优选荧光蛋白。

1. 绿色荧光蛋白（GFPs）

EGFP（ex488/em510）因与488nm激光匹配良好，是流式最常用的FP。mEmerald、mNeonGreen等性能优异。建议搭配BP510/20等窄带滤光片以提升信噪比。

2. 蓝/青色荧光蛋白（BFPs & CFPs）

BFPs（如eBFP2）需紫外/紫激光（~355–405nm）激发；CFPs（如Cerulean、eCFP）可由405nm激光有效激发。AmCyan（ex458/em489）已用于抗体偶联，拓展了紫激光的应用。

3. 黄色荧光蛋白（YFPs）

Venus、Citrine等最佳激发在514–532nm，但在488nm仪器上也可检测，建议YFP使用BP550/30等滤光片，注意与GFP区分。

4. 橙/红色荧光蛋白（OFPs & RFPs） 

源自珊瑚，如tdTomato、mCherry、mRuby，适合561nm激光激发，组织穿透性好。避免使用488nm检测mCherry。

5. 红外荧光蛋白（iRFPs） 

源于细菌光敏色素，结合内源胆绿素发光，需630nm以上激光激发，为高维流式分析提供新选择。