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【技术分享】Sirt1靶点检测详解

人阅读 发布时间:2021-01-28 14:35

Sirt1是什么?

 

Sirt1是一个全长747aa的NAD依赖的脱乙酰化酶, 属于sirtuin家族。翻译后修饰的SIRT1是一个110-130kda的蛋白质,包含一个脱乙酰酶sirtuin型结构域。TNF-alpha处理可诱发C末端缺失的75-80kda的SirT1片段, 另外SirT1存在一个57-61kda的亚型。SIRT1可能存在于核仁、核常染色质、异染色质和内膜中。它能在细胞核和细胞质之间穿梭。SIRT1通过催化关键蛋白的去乙酰化来调节细胞凋亡和肌肉分化等过程,在氧化应激和DNA损伤修复中发挥重要作用(见图1)。

 

Sirt1的WB检测

 

在 Western Blot 实验中,样本准备是实验成功的第一步。

 

1.裂解样本时加入足量的蛋白酶抑制剂防止蛋白降解。

 

2.该蛋白高度修饰,分子量达到130kd,可在转膜液中加入终浓度 0.1% 的 SDS 以提高转膜效率。

3.使用 Bradford,Lowry 或 BCA 法对总蛋白进行定量。每个泳道加入 20-50μg 总蛋白,确保sirt1

   含量在 WB 检测限之上。

 

背景过高是 Western Blot 中常常出现的问题。对于此类问题,建议优化抗体浓度以获得最佳的信噪比,使用菲恩生物FNab07877 anti- SIRT1 antibody进行WB检测结果如下(图2):

 

Western blot-FNab07877 anti- SIRT1 antibody

 

Sirt1的IHC检测

 

组织块从生物体上取下后由于酶的作用会迅速降解。所以需要通过化学试剂的作用使蛋白交联(paraformaldehyde,福尔马林等),防止组织自溶,维持抗原性并防止抗原弥散。但是过度固定会封闭抗原表位,导致信号减弱甚至消失。另外,一抗的浓度对于实验结果非常重要。浓度过低得不到阳性信号,浓度过高可能产生非特异性结合,造成假阳性。

 

Sirt1定位于细胞核,为获得理想的染色结果,建议:

1.根据组织块大小和类型确定固定时间,一般在4% paraformaldehyde固定 18-24 小时。

 

2.推荐使用 pH 6 的枸橼酸钠,热修复 20-30 分钟或使用胰蛋白酶、蛋白酶 K 进行酶修复。

 

3.若切片厚度大于 5μm,推荐使用 0.2% Triton X-100 PBS 对切片进行通透处理 10 分钟。使用菲

   恩生物FNab07877 anti- SIRT1 antibody进行IHC检测结果如下(图3):

 

Immunohistochemistry-FNab07877 anti- SIRT1 antibody (200倍放大)

 

Sirt1的IF检测

 

相比于与组织切片,培养的细胞需要固定的时间更短,同时醛基的自发荧光对于荧光检测常常带来干扰。

 

为了获得更好的实验结果,推荐:

1.使用 4% PFA 固定细胞 20 分钟,过度固定会使信号减弱。

 

2.使用 0.3M 甘氨酸淬灭醛基引起的自发荧光。

 

3.检测细胞核内抗原Sirt1时,使用 0.1% Triton X-100 对细胞进行 5 分钟的通透处理。使用菲生

   物FNab07877 anti- SIRT1 antibody进行IF检测结果如下(图4):

 

Immunofluorescence-FNab07877 anti- SIRT1 antibody (200倍放大)

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