Ni 柱是大家在蛋白纯化中，应用最多的一种纯化柱料，属于固定化金属离子亲和色谱（immobilized metal ion affinity chromatography，IMAC）中的一种，1975 年由 Porath 等发明，其间不断完善发展至今。



原理

过渡金属通过与电子供体配基上，能与金属离子相互作用的羧基或氨基的电负性元素（O，N），形成较稳定的金属螯合物。在 IMAC 中，一个 Ni2+ 有六个配位位点，被含有 3、4 或 5 个电子供体基团（配位位点）的螯合物固定在吸附剂上，而剩下未被占据的位点暴露于溶液中，能与组氨酸，半胱氨酸，和色氨酸的侧链或组氨酸标签的蛋白特异性结合。

IMAC 的螯合配基，常见有 IDA（亚氨基二乙酸），NTA（次氮基三乙酸），TED（羧甲基乙，二胺等，分别拥有 3、4、5 个配位位点与 Ni2+ 结合，而空余的能与组氨酸标签结合的位点还剩 3、2、1 个。所以 IDA 与 His 标签蛋白结合力相对最强，特异性较弱，而 TED 则相反。我们在实际应用中通常选择载量与特异性适中的 NTA 类型。



使用

Ni 柱的洗脱通常采用竞争洗脱，先用低浓度的咪唑将杂蛋白和结合不牢的蛋白洗去，再用合适的浓度将目的蛋白洗脱。洗脱的先后顺序与蛋白的结合能力相关。
 

Ned-Ni	NTA-Ni

另外，在 Ni 柱的使用中，应当避免缓冲液中存在还原剂和螯合剂，以免 Ni2+ 被还原而脱落。如果柱料使用太久积累了很多杂蛋白，可用 EDTA 将 Ni2+ 螯合下来，再用 NaOH 清洗柱料后，重新螯合 Ni 离子，即可完成再生。平时不用时，应保存在 20% 乙醇中防止长菌。