流式细胞术 | 固有淋巴细胞检测方式及注意事项

固有淋巴细胞（ILCs）是一类缺乏抗原特异性受体的淋巴细胞，涵盖NK细胞、LTi及ILC1、ILC2、ILC3等亚群。它们与T、B细胞同源，均起源于淋巴样祖细胞（CLP），并经由EILP发育成熟。ILCs不仅通过分泌细胞因子维持黏膜免疫和调节机体应答，还在组织稳态、代谢修复中发挥关键作用。其功能与辅助性T细胞高度对应：ILC1、ILC2、ILC3分别类似Th1、Th2、Th17，而NK细胞的功能则与CD8+ T细胞雷同。

主要表型标志物

上表详细列出了小鼠与人类固有淋巴细胞（ILCs）各亚群的主要表型标志物。这些标志物涵盖细胞表面分子（如CD45、CD127等）及转录因子（如Tbet、GATA3等）。

表格对比了NK细胞、ILC1、ILC2、ILC3及LTi细胞在不同物种间的表达差异，通过“+”、“-”或强度等级区分。值得注意的是，尽管总体模式保守，但部分标志物（如CD161、Sca-1）在小鼠和人类间存在显著区别，且某些标记物的表达受器官特异性影响。这为精准鉴定和区分各类ILCs提供了重要依据。

人固有淋巴细胞表型
下图表展示了利用流式细胞术鉴定固有淋巴细胞（ILCs）及其亚群的通用免疫表型策略。首先，所有ILCs均被定义为CD45阳性且系别阴性（Lin-），其中Lin-排除了T细胞、B细胞、髓系细胞等其他免疫谱系。在此基础上，通过关键表面标志物区分各亚群：NK细胞表达CD94及不同强度的CD56；而辅助性ILC1、ILC2和ILC3均为CD94阴性但表达CD127。进一步区分这三类细胞依赖于CD117（c-kit）和CRTH2的表达差异：ILC1为双阴性，ILC2通常为CRTH2阳性，而ILC3则为CD117阳性且CRTH2阴性。这一组合标记法是精准分离和研究各类ILCs的基础。

小鼠固有淋巴细胞表型
下图表展示了小鼠固有淋巴细胞（ILCs）的鉴定策略，主要依赖胞内转录因子进行分群。

首先，所有目标细胞均为CD45阳性且系别阴性（Lin-），其中Lin-组合排除了T/B细胞、髓系细胞及肥大细胞等。在此基础上，通过关键转录因子区分亚群：NK细胞和ILC1均表达T-bet但不表达RORγt，区别在于NK细胞高表达Eomes且通常表达NKp46，而ILC1为Eomes阴性；ILC2特征为GATA3阳性且RORγt阴性；ILC3则表现为RORγt阳性且GATA3低表达或不表达。这一基于转录因子的 gating 策略是精准分析小鼠ILCs功能亚群的核心方法。

下图展示了小鼠固有淋巴细胞（ILCs）的流式细胞术鉴定策略。首先通过FSC/SSC圈定单核细胞，利用Lin-和TCRβ/γδ阴性排除T/B及髓系细胞，结合CD127+确定ILCs群体。随后依据转录因子Eomes、T-bet、GATA3和RORγt的表达差异，将ILCs精准分为NK、ILC1、ILC2和ILC3亚群，其中ILC3还可进一步根据CD4和NKp46细分。

注意事项

检测固有淋巴细胞（ILCs）需注意以下四点：首先，因ILCs占比极低，需通过Percoll密度梯度离心、CD127磁珠分选或去除T/B细胞等富集手段提高比例以节省成本。其次，鉴于其标记特异性有限且存在组织差异（如NKp44仅在组织中用于区分ILC3亚群），需联合多种抗体排除干扰。第三，Lin混合抗体主要用于排除T/B/髓系等杂细胞，可与死活染料共用通道；但在脐血等特殊样本中，需额外增加CD235a和CD66b以排除红系及粒系前体。最后，可参照辅助T细胞流程进行刺激实验，检测ILCs胞内细胞因子的表达情况。

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