流式实验秘籍：3种巨噬细胞极化方案！（建议收藏）

巨噬细胞极化

除了M1和M2型巨噬细胞，肿瘤微环境中还存在肿瘤相关巨噬细胞（TAM），主要表达CD163、CD206和Arg等标志物，促进肿瘤生长和转移。TAM分泌生长因子，如血管内皮生长因子（VEGF），刺激血管生成并促进肿瘤细胞增殖；同时，它们产生免疫抑制细胞因子（如IL-10），抑制T细胞等抗癌免疫细胞的活性。此外，TAM还通过改变肿瘤细胞的新陈代谢，提供生长所需的营养和能量，成为肿瘤研究的重要亚群。

实验方案：

❶ 使用Ficoll从外周血中分离PBMCs。

❷ 通过CD14单核细胞磁珠分选试剂盒富集单核细胞，或将10-20 x 10⁶ PBMC种在2ml无血清培养基中，2-3小时后洗去未黏附细胞，获得约1 x 10⁶个单核细胞。

❸ 在6孔板中加入含M-CSF（50 ng/ml）的培养基，将单核细胞浓度调整为1-2 x 10⁶/ml，诱导分化为巨噬细胞。

❹ 3天后吸出1ml培养基，补充1ml新鲜培养基。

❺ 6天后诱导M1和M2极化，分别添加LPS（10 ng/ml）和IFN-γ（50 ng/ml）或IL-4（20 ng/ml），刺激18-20小时。

❻ 最后通过流式细胞术检测M1、M2相关Marker的表达。

肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤生长和转移中扮演重要角色。以下是一种利用肿瘤细胞来源的条件培养基诱导人单核细胞分化为肿瘤相关巨噬细胞的实验方法。

实验方案：

❶ 使用Ficoll从外周血中分离PBMCs。

❷ 通过CD14单核细胞磁珠分选试剂盒富集单核细胞。

❸ 利用流式细胞术检测单核细胞的纯度，确保纯度在95%以上。

❹ 将1 x 10⁶ CD14+单核细胞用1ml完全培养基重悬，种入24孔板。

❺ 制备肿瘤来源的条件培养基：将2.5 x 10⁵黑色素瘤细胞种在6孔板中培养过夜，洗净后加入1ml无血清培养基培养48小时，离心去碎片并过滤，定量至70 µg/ml。

❻ 从24孔板中取出500 µl培养基，加入500 µl肿瘤来源的条件培养基，诱导单核细胞分化为肿瘤相关巨噬细胞。

❼ 培养72小时后，通过流式细胞术检测肿瘤相关巨噬细胞。