新手必备 | 如何选择合适的流式抗体？

流式抗体本身也是抗体，所以首先要满足抗体选择的最基本条件：

靶标类型：明确靶标是胞内还是胞外蛋白。胞内蛋白需预处理以使抗体进入细胞，而胞外蛋白则直接标记细胞表面。

样品来源匹配：选择与样品来源相匹配的抗体，避免物种间的交叉反应，提高实验的特异性和准确性。

流式细胞术专用抗体：务必选择标注为适用于流式细胞术的抗体，以确保其在流式细胞仪中的性能和数据的准确性。

激光配置：确认流式细胞仪上的激光器数量和波长。常见的配置包括 488 nm 和 635 nm 激光器，但一些仪器可能仅装配一个激光器。因此，即使是相同型号的设备，其激光配置也可能不同，这可能影响你的实验设计。

滤光片数量：了解仪器配备的滤光片数量，即检测通道的数量。这决定了你可以同时检测的参数数量。例如，如果仪器有多个滤光片，你可以同时检测更多的荧光标记。

仪器型号：确认流式细胞仪的具体型号，有助于了解其检测通道的配置。不同型号的仪器可能会有不同的通道配置，即使是相同的荧光标记，其在不同仪器上的检测通道设置也可能有所不同。

在选择流式细胞术抗体时，建议优先使用直接标记荧光的抗体。相比于间接标记的二抗，直接标记抗体可以减少实验步骤，避免多次清洗带来的细胞浪费，并提高实验的准确性。荧光的强度也会影响结果，根据抗原表达的强弱及分群情况选择适当的荧光标记。如果抗原表达较弱或分群不明显，建议使用强荧光如PE，以增强信号；而对于抗原表达强或分群明显的情况，可以选择弱荧光如FITC。常见荧光的强度排序为：PE > APC > PE-Cy5 > PerCP-Cy5.5 > FITC。还可以考虑使用新型荧光如Alexa Fluor和eFluor，这些标记物具有更高的亮度、优良的激光稳定性和对pH值的不敏感性。例如，尽管Alexa Fluor 488和FITC使用相同的检测通道，但Alexa Fluor 488在信号强度和淬灭时间上明显优于FITC。

在流式细胞术中，设计荧光标记方案时应注意以下几点：

通道选择：每个检测通道只能使用一种荧光标记。各通道之间的荧光标记可以自由搭配。例如，如果在FL1通道使用了FITC标记的抗体，那么不能在同一实验中再选择Alexa Fluor 488标记的抗体。不过，其他通道的抗体可以选择PE、APC等不同的标记物进行组合。

荧光重叠：尽量减少荧光素光谱的重叠，以避免补偿困难。例如，PE-Cy5与APC的光谱重叠较大，会导致补偿问题，建议使用PE-Cy5.5或PerCP-Cy5.5来避免这种情况。常用的四色荧光组合为：FITC、PE、PerCP-Cy5.5、APC。

多色分析：在进行多色分析时，特别是五色以上的实验，可能会受到荧光标记种类的限制。建议参考多家抗体公司的产品，并在需要时咨询专业人员，以设计合适的实验方案。

同型对照（Isotype Control）用于消除抗体非特异性结合产生的背景染色，是真正的流式阴性对照。它不仅帮助设定流式细胞仪的电压，还省去复杂的竞争封闭步骤。

选择同型对照时，应使用与一抗相同种属、亚型、亚链及荧光标记的免疫球蛋白，并保持剂量一致。荧光一抗的说明书通常会提供对应同型对照的货号。如果使用纯化的一抗加荧光标记的二抗，则应选择相应的同型对照抗体，例如，纯化CD3+PE标记的二抗样品管应使用纯化的同型对照加PE标记的二抗作为对照。对于细胞表面或胞内抗原表达低且类似抗原众多的情况，同型对照可能因非特异性结合而导致较高表达，此时推荐使用空白对照等其他阴性对照。不熟悉流式操作或检测胞内因子时，建议使用同型对照；而熟悉操作且了解抗体表达的用户可以考虑省略同型对照。

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