PART1

一 抗 选 择 指 南

图1一抗结构

一抗是能和对应抗原特异性结合的免疫球蛋白，种类包括单克隆抗体和多克隆抗体。检测任何靶蛋白都有多种抗体可供选择，一抗选择主要考虑以下几点因素：

 

（1）确定实验样本的种属

首先确定所检测样本的种属，如human、mouse、rat、dog、rabbit等。应该选择反应种属包含有样本种属的抗体。由于氨基酸序列同源性较高，抗体可能与不同物种的同种靶蛋白有交叉反应。如果样本的种属未列入抗体说明书上的反应种属中，并不意味着该抗体不适用于检测该物种的蛋白，而只是表示该物种尚未用此抗体验证过。可以通过序列比对的方法来预测交叉反应，可应用Expasy和NCBI BLAST来进行不同物种蛋白同源性比对。如果比对结果证明同源性较高，也是可以考虑测试下。

（2）确定实验类型

确定自己的实验类型，如ELISA、WB、IHC、IP、FC等，选择包含该应用的抗体。一般抗体说明书会列出该抗体经试验验证过的实验类型，如未提及并不意味着该抗体不适用于该应用，而仅是说明尚未经过该应用的验证，未包含应用的具体情况可向厂家咨询。

（3）抗体宿主物种的选择

一般建议样本种属与抗体宿主物种的亲缘性越远越好，不宜同源。对于免疫组化而言，如果使用未偶联一抗和偶联物标记二抗，尽可能选择与样本不同种系物种的一抗，从而避免二抗与样本内源性免疫球蛋白产生交叉反应，例如：检测小鼠样本，则不应选择小鼠或大鼠源的一抗，而是选兔源的一抗，二抗则可选择偶联了检测分子（酶、荧光素、生物素等）的抗兔IgG。如果直接使用偶联物标记一抗则不适用上述情况，对不含内源性免疫球蛋白样本的检测方法，则抗体宿主物种的影响不大。

（4）单克隆与多克隆的选择

在抗体抗原反应中，一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对较小，检测灵敏度相对较低；而多克隆抗体特异性稍弱，但亲和力较强，检测灵敏度较高。如果使用多克隆抗体发现有很多无法去除的非特异条带，建议换成单克隆抗体。

PART2
二 抗 选 择 指 南

02一抗和二抗结合模式图​

二抗是能和一抗结合的抗体，上面通常连有酶或荧光素等。二抗针对某一特定物种抗体均具有特异性，因而使用标记的二抗可以免去对每一个一抗进行标记，节省了时间和费用；此外，一个一抗分子可以同时结合几个二抗分子，从而使信号增强，提高了实验灵敏度。二抗可以偶联有几种不同的标记，可以是酶，荧光素，或生物素。

如何选择二抗？通常情况下，某一特定的实验中可能同时有几种二抗可供选择，如何能选择到适合该实验的二抗，需要综合以下几个方面进行考虑：

（1）一抗的物种来源

根据一抗的物种来源选择相应的抗该物种的二抗。如果一抗是小鼠来源的抗体，二抗则选抗小鼠的二抗；如果一抗是兔来源抗体，则相应的二抗需要选择抗兔的二抗。

（2）一抗的亚型   

一般来说多克隆抗体主要是IgG类免疫球蛋白，因此相应的二抗就是抗IgG抗体。而单克隆抗体则相对复杂些，具有多种亚型，二抗除了要与一抗的种属来源相一致，还需与一抗的亚型相匹配。如一抗亚型为小鼠IgG2a，那边二抗需要抗小鼠IgG2a。

（3）二抗的种属来源

一般来说，不同的种属来源的二抗在实验里没有太多的差别。然而在一些特殊的实验里，如双标实验里，如果其中一个一抗是山羊来源的，一个是小鼠来源的，则相应的二抗分别要抗山羊和抗小鼠的二抗，此时二抗就不能选山羊或者小鼠来源的。选择相应的驴来源的二抗，就非常适合做类似双标的免疫实验。

（4）选择哪种形式的二抗，是整个IgG分子，Fab片段，还是F(ab')2片段？

整个IgG分子：此种抗体适用于多数情况。

Fab片段：它们只有一个结合位点，一般用来封闭内源性免疫球蛋白。

F(ab')2片段：该种抗体是由两个靠二硫键连接的用于结合抗原的Fab片段组成，这些抗体用在特定的情况中，如需要避免抗体与具有Fc受体的细胞结合的情况。

（5）二抗的偶联标记

一般来讲，偶联到二抗上的探针主要有酶（辣根过氧化酶HRP和碱性磷酸酶AP等），荧光基团（FITC, TR, PE）和生物素。选用哪种探针的二抗主要取决于具体的实验。对于IHC, WB和ELISA，常用的二抗是酶标二抗，而细胞或组织的免疫荧光实验和流式细胞术中通常使用荧光基团标记的二抗。

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