免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及相对定量的研究。

然而理想是丰满的，实际操作起来却是骨感的，作为一种分析方法，常常会存在非特异着色的背景问题。下图中靶点均为胞膜定位，左边背景着色严重，右边染色效果优良。



01 抗体质量问题

抗体本身在靶点设计上如果特异性不够，会导致非特异着色。一般来说，单抗在特异性上相比多抗是具有优势的，但多抗由于识别任一抗原上的多个表位，多抗可放大低表达水平靶蛋白的信号，对微小抗原变化（例如多态性、糖基化异质性或者轻微变性）的包容性更强，可用于非免疫原物种的靶蛋白的检测实验。具体实验时，还应根据实际需要选择合适的抗体。另外，抗体保存也应注意防腐及防止反复冻融。

02 内源性酶和生物素

当选用肝、肾，脾组织作为样本时，由于这些组织本身含有较高含量的过氧化酶和生物素，对于使用Hrp或生物素-亲和素显色系统的实验都会造成非特异性染色。对于内源性过氧化物酶，可以用 0.9% 的双yang水来灭活。对于内源性生物素，染色前将切片浸于 25 μg/mL 亲和素溶液中 15 分钟，PBS 清洗 15 分钟后即可染色。也可以 24 mg/mL 的卵白素封片 15 分钟。

03 抗体浓度过高

获得良好的染色结果，一般应优化一抗的使用浓度，可参考供应商提供的说明书，但预实验也是必不可少的，摸索出最理想的工作浓度。

04 DAB 染色时间太长/变质

DAB 的作用时间过长，同样会造成背景。DAB 的显色时间不是一成不变的，实验时应及时镜检，出现浅棕色时，马上冲洗。出现棕色的时间过短，表明抗体浓度过高；出现棕色的时间过长，表明抗体有效浓度过低。DAB 要保存于避光干燥的地方，现用现配，临用前才加入 H₂O₂。下图分别为同一指标显色正常（左）和过度（右）的效果对比。



05 组织变干

另外，整个实验过程中应保持样本表面和外围湿润，避免因试剂流失导致背景的产生。显色时，一次不要同时染过多张片子，可分批显色。

06 浸泡时间过长

切片应避免在缓冲液或修复液里面浸泡过夜，整个实验过程应是连贯的，减少非必要程序和未知因素干扰。

07 清洗不充分

抗体孵育后的清洗应充分，PBS 使用前应确定 pH 值，必要时可添加 Tween-20 增加洗涤强度。

08 封闭问题

免疫组化一般使用血清稀释液进行封闭，为排除二抗本身造成的非特异吸附，可使用二抗动物的非免疫血清，例如二抗是羊抗兔，就要选择非免疫羊血清。用PBS稀释为 3-10% 的溶液孵育切片，37 °C 10-30 分钟，封闭后不用清洗，直接甩掉即可。另外组织固定后可能会残留部分游离醛基，在孵育抗体过程中也可能产生非特异结合，此时可使用 0.3M 甘氨酸进行封闭。

以上就是免疫组化实验中常见的背景着色的原因，希望对大家的实验结果改进有帮助。

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