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IHC实验中多聚酶二抗能明显放大信号

人阅读 发布时间:2020-12-29 11:42

多聚酶二抗介绍
过氧化物酶标记的抗体方法于 1968 年推出,是大多数临床和研究中石蜡包埋组织抗体的首次实践应用(Nakane,1968)。然而常规的二抗-HRP 结合物每个 IgG 分子上最多能结合 3 个 HRP 分子。这种结合物的分子量能满足常规的 WB 和 Elisa 实验要求,但在检测目标蛋白分子量含量很低时,如果不通过额外的步骤来放大信号,会降低检测靶标所需的灵敏度。IHC 实验时尤为明显。

在过去的几十年中,IHC 实验用试剂和实验方案上的改进增加了这套检测系统的灵敏度。基于酶-抗-酶免疫复合物技术(PAP 和 APA-AP)(Sternberger et al., 1970)和标准的抗生物素蛋白 / 链霉抗生物素蛋白-生物素-复合物技术(ABC 或 SABC)以及标记的链霉素-生物素(LSAB)技术,再通过多聚酶结合,这种新方法使检测抗原的能力比之前提高好几倍。

然而 PAP 和 APA-AP 方法会形成巨大的骨架结构导致检测物质体积过大而容易发生遮蔽和位阻现象(如细胞核抗原的检测),使其难以进入到组织样品内部而导致灵敏度降低(for review see: Shi et al., 1999 and citations therein)。

人体内很多组织分布有生物素(维生素 H),它可以和 ABC/SABC 结合产生非特异性染色。同时为了减少实验步骤,加强信号,需要一种容易渗透到组织内部,降低非特异反应,并能提高信号强度的检测系统来代替传统的方法。

FineTest® IHC Kits 采用了一种新的多聚酶二抗系统(包括 poly-HRP 羊抗兔 IgG 和 poly-HRP 羊抗小鼠 IgG)。更多的酶可以通过链接臂结构链接到单分子的抗体上,形成最合适的复合物结构,从而在免疫组化实验中提高信号强度,同时简化了实验程序。

各检测系统的差异:
Amplification  system Size Components The experimental steps Signal
PAP,APA-AP Very large>5000kd Anti-HRP-IgG
HRP
HRP-IgG
1.primary antibody
2.PAP or APA-AP
Medium
ABC(SABC) Large>2000kd Avidin(Streptavidin)
Biotin-HRP
1.primary antibody
2.biotin-secondary antibody
3.ABC(SABC)
Strong
Poly-HRP-IgG Medium:700~1200kd HRP(multiple)-IgG
(secondary antibody)
1.primary antibody
2.secondary antibody
Very strong
HRP-IgG(normal) Small:200~282kd HRP(1-3)-IgG
(secondary antibody)
1.primary antibody
2.secondary antibody
Weak or none
显色对比试验
abcam(ab209101)多聚酶二抗,DAB显色1分钟 FineTest® 多聚酶二抗,DAB 显色1分钟
市面常见的商品化产品,SABC 显色1分钟 FineTest® 多聚酶二抗,DAB 显色1分钟

原理示意图:

IHC 测试结果
分别进行了高浓度和低浓度的目标抗原 IHC 实验。其中一抗,多聚酶二抗和 DAB 试剂盒均来自FineTest®
较高浓度的目标抗原:
Antibodies Dilution Location Cat. No.
Histone H3.3(A) 1:150 Nucleus FNab03888
PCNA(B) 1:200 Nucleus FNab06216
a-Tubulin(C) 1:300 Cytoplasm, Cytoskeleton FNab00333
GAPDH(D) 1:500 Cytoplasm, Nucleus FNab03342
Lamin A/C(E) 1:400 Nucleus FNab04681
VDAC1(F) 1:400 Cell membrane, tochondrion FNab09826
β-actin(monoclonal)(G) 1:250 Cytoplasm, Cytoskeleton FNab00873

较低浓度的目标抗原:
Antibodies Dilution Location Cat. No.
TRX-1(H) 1:300 Cytoplasm, Nucleus FNab09033
PXMP2(I) 1:150 Peroxisome membrane FNab06965
TTK(J) 1:200 Cytoskeleton FNab09094
MEK3(K) 1:300 Cytoplasm, Nucleus FNab05114
MAP3K3(L) 1:300 Cytoplasm FNab09830
HDAC5(M) 1:250 Cytoplasm, Nucleus FNab03802
P2RX7(N) 1:250 Cell membrane FNab06071
  
  
  
  

人体肾脏组织(A,D,F,N),人体肝癌组织(B,E),人体乳腺癌组织(C,J,K), 人体结肠癌组织(H,I,L,M) 和大鼠心脏组织(G)。多聚酶二抗 Poly-HRP Goat anti rabbit IgGPoly-HRP Goat anti mouse IgG 按照 1:100 稀释。DAB 染色 10 分钟,细胞核用苏木-精复染。


阴性对照试验
 
 
人体心脏组织(1),人体结肠癌组织(2),大鼠肝脏组织(3),人体乳腺癌组织(4)。一抗为阴性血清,多聚酶二抗 Poly-HRP Goat anti rabbit IgGPoly-HRP Goat anti mouse IgG 按照 1:50 稀释。DAB 染色 10 分钟,细胞核用苏木-精复染。


总结
使用多聚酶二抗做 IHC 实验,获得了明显放大的信号,未出现非特异性结合,并且大大简化了实验程序。

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